Il progetto GAME

di Dr Andrea Gandolfi Centro Sperimentale IASMA - Fondazione E. Mach

(pubblicato sulla nostra rivista  “Le nostre acque” – anno 2008)

Il progetto GAME

A partire dal Marzo 2006, il Centro Sperimentale dell’Istituto Agrario di San Michele all’Adige (IASMA), ora Fondazione Edmund Mach, in collaborazione con l’Autorità di Bacino del Fiume Adige (AdBA), ha avviato il progetto di ricerca GAME - “Gestione sostenibile della trota mar-morata (S. t. marmoratus) nel Bacino dell’Adige: caratterizzazione genetica, fenotipica ed ecologica finalizzate alla conservazione”. Tale programma triennale di studio si proponeva di operare su scala di intero Bacino idrografico coinvolgendo le Amministrazioni (BZ, TN e VR), gli Enti e le Associazioni interessati, in diversi modi e misure, alla gestione della trota marmorata, al fine di ottenere protocolli di analisi e di attività condivisi e un coordinamento nell’applicazione degli stessi. A tal scopo sono stati richiesti e formalizzati un rapporto di collaborazione con gli Uffici prepo­sti alla gestione della fauna ittica delle province di Bolzano, Trento e Verona e un contributo e un sostegno attivi ad alcune Associazioni di Pescatori operanti sul territorio.

Il principale pericolo evidenziato per la sopravvivenza della marmorata è rappresentato dalla massiccia e ripetuta immissione nell’ambiente, a scopo alieutico, di trote fario di allevamento che ne mettono a rischio l’integrità genetica, competono per l’alimentazione e favoriscono la diffusione di patologie. Il progetto, quindi, si poneva come obiettivi specifici:

a)     l’individuazione, per mezzo di un approccio genetico e morfometrico, degli individui e delle popolazioni autoctone superstiti di trota marmorata nel Bacino dell’Adige

b)   la caratterizzazione degli ambienti che le ospitano, in particolare delle aree di riproduzione

c)        l’elaborazione di un piano gestionale sostenibile delle popolazioni e dei loro habitat, finalizzato al ripristino qualitativo e quantitativo e alla conservazione del taxon.

Per raggiungere gli obiettivi prefissati è stato predisposto un piano di campionamento su alcuni tratti fluviali del bacino dell’Adige e dei suoi affluenti in stazioni rappresentative e idonee alla presenza della marmorata. Il campionamento è stato effettuato negli ambienti naturali tramite elettropesca o in impianti allevativi senza il sacrificio degli individui catturati: prima del rilascio nell’ambiente,ogni individuo è stato anestetizzato, misurato e pesato, è stato fotografato su entrambi i lati per consentire l’analisi morfometrica ed è stato infine sottoposto al prelievo di un frammento di pinna caudale, per la successiva analisi genetica, e di alcune scaglie, per la determinazione dell’età. Ogni individuo è stato inoltre assegnato alla classe fenotipica fario, marmorata o ibrida, sulla base di un analisi visiva effettuata da personale di comprovata esperienza, così come avviene normalmente per la selezione dei riproduttori nel corso delle campagne ittiogeniche. Complessivamente sono stati studiati oltre 1000 individui provenienti da 54 siti di campionamento, incluse 4 popolazioni slovene di marmorata pura provenienti dal bacino del Soča (Isonzo).

In laboratorio sono state realizzate le analisi genetica (con l’utilizzo di marcatori del DNA nucleare e mitocondriale) e morfometrica. I dati così ottenuti relativamente al genotipo ed al fenotipo di ciascun individuo, confrontati con quelli di tutti gli altri individui analizzati nel presente studio, hanno consentito di formulare un’ipotesi relativamente al grado di purezza di ciascun individuo e alle caratteristiche di similarità o unicità delle diverse popolazioni.

I risultati dell’indagine genetica: l’ibridazione con la fario 

Su un totale di 1077 individui presi in considerazione nel presente studio, 440 risultano essere marmorate geneticamente pure, ovvero appartenenti al gruppo mitocondriale marmoratus e con una probabilità di appartenere al gruppo genotipico marmorata definito sulla base dei marcatori del DNA nucleare superiore al 95% e pertanto significativa. E’ altresì evidente che l’alta percentuale di marmorate pure (ca. 40%) non è rappresentativa della reale situazione del bacino, essendo lo studio finalizzato allo studio della marmorata ed essendo quindi il campionamento sbilanciato verso la cattura di individui di questo taxon. Di tali soggetti puri, meno della metà, ovvero solo 215, sono stati riconosciuti come tali mediante il metodo di riconoscimento fenotipico comunemente usato per la selezione dei riproduttori. Le rimanenti marmorate geneticamente pure sono state assegnate su base fenotipica ai gruppifario (6 casi) e ibrido (219 casi). Oltre la metà quindi delle marmorate pure sarebbe stata scartata in un processo di selezione di riproduttori effettuata secondo i criteri attualmente utilizzati nel corso delle campagne di ripopolamento. Ciò può comportare una perdita di diversità genetica naturale della trota marmorata ad ogni ciclo di riproduzione artificiale, e un conseguente calo esponenziale in generazioni successive, ingenerando probabili fenomeni di depressione da inincrocio o comunque, in generale, determinando una riduzione del potenziale adattativo. Duecento individui considerati marmorate pure all’analisi del fenotipo si sono invece rivelati come probabili ibridi all’analisi genetica. In questo caso, l’inclusione di tali individui nei programmi di riproduzione artificiale e ripopolamento, comporterebbe l’introgressione di alleli alloctoni nella trota marmorata. E’ addirittura possibile ipotizzare che, a causa di un’errata assegnazione di ibridi al gruppo marmorata puro, sia proprio la pratica di riproduzione artificiale più che la riproduzione in ambiente naturale ad accrescere il fenomeno dell’ibridazione. 

I risultati dell’indagine genetica: i ceppi di marmorata 

Sulla base dei dati genetici relativi alle sole marmorate geneticamente pure è stato possibile evidenziare l’appartenenza dei campioni analizzati a tre diversi ceppi di marmorata: un primo ceppo a cui appartenevano i soli campioni provenienti dalle popolazioni slovene, e due presenti invece nel bacino dell’Adige e quindi potenzialmente autoctoni. Di questi ultimi, un ceppo risulta quasi esclusivamente distribuito nei sottobacini del Noce, dell’Avisio e del Fersina, i principali affluenti dell’Adige in territorio Trentino; il secondo ceppo è invece distribuito prevalentemente lungo l’Adige stesso, ma solo nel suo tratto inferiore, dal basso Trentino al Veronese. Le rimanenti stazioni di campionamento sono caratterizzate dalla presenza di individui che presentano caratteristiche intermedie tra i due ceppi, e quindi probabilmente originate dalla mescolanza degli stessi. In particolare ciò è evidente su tutto il territorio di Bolzano, dove è minore il numero di individui risultati puri e dove questi stessi presentano appunto genotipi misti dei due ceppi. E’ da notare che gli individui del ceppo distribuito nel basso corso dell’Adige mostrano un elevata similarità con alcuni individui di riferimento provenienti dal Piemonte. L’ipotesi più semplice per spiegare tale somiglianza è quella di considerare la possibilità che gli stessi campioni piemontesi abbiano in realtà origine trentina. Questa ipotesi rimane da dimostrare, ma sarebbe comunque in accordo con i numerosi dati storici di vendita e traslocazione di materiale ittico dal Trentino-Alto Adige ad altre regioni del Nord Italia. In tutti i casi, un’attenta ricostruzione degli eventi di traslocazione di trota marmorata entro il bacino dell’Adige e tra i sottobacini dei suoi affluenti potrà certamente contribuire a meglio interpretare e comprendere le evidenze risultanti dall’indagine genetica. 

La collaborazione GAME-APDV 

Fin dall’inizio del progetto GAME, l’Associazione Pescatori Dilettanti Vallagarina, ha saputo contribuire alle attività di campionamento previste, mettendo a disposizione la conoscenza del territorio e l’esperienza di Andrea Aiardi e di Claudio Giordani nelle campagne di cattura degli individui in siti rappresentativi delle acque gestite dall’Associazione. Nel Novembre 2007 il sottoscritto, responsabile scientifico del progetto GAME ha sollecitato e ottenuto, in accordo con il presidente Roberto Bettinazzi, una partecipazione ancora più attiva e diretta dell’APDV, a contribuire al raggiungimento degli obiettivi del progetto. E’ stata dunque concordata la realizzazione di un esperimento di incrocio fattoriale su riproduttori selezionati su base genetica nell’impianto di Rovereto. Tale esperimento ha costituito una prima prova di trasferimento sul territorio dei risultati, seppur preliminari, e dei metodi messi a punto nel corso del progetto in svolgimento. La ricerca di una collaborazione e partecipazione diretta dei principali attori della gestione delle popolazioni di trota marmorata, ovvero delle Associazioni dei Pescatori operanti sul territorio, è infatti uno dei punti fermi del progetto GAME per due fondamentali motivi: in primo luogo, poiché solo le Associazioni sono in grado di fornire il materiale proveniente dal territorio stesso e che quindi costituisce il più idoneo oggetto di studio; in secondo luogo, non meno importante ai fini del pro­getto, poiché alle stesse Associazioni i risultati della sperimentazione dovranno essere trasferiti al fine di agevolare e migliorare le pratiche gestionali da queste stesse messe in atto. La disponibilità di APDV ha permesso quindi di gettare le basi per la realizzazione di questo importante obiettivo. Per contro, APDV ha avuto la possibilità di caratterizzare da un punto di vista genetico alcuni individui allevati presso il proprio impianto, condizione indispensabile e ormai imprescindibile per la produzione di materiale da rimonta di oggettiva qualità. In particolare è stato possibile valutare il livello di purezza di tutti gli individui analizzati e le performance come ripro­duttori di un sottocampione degli stessi.

 Le marmorate dell’impianto di Rovereto 

Entro l’impianto di Rovereto, sono stati marcati mediante pit-tag e analizzati 48 individui provenienti da 2 lotti, rappresentati rispettivamente da 19 femmine e 15 maschi il primo e da 5 femmine e 9 maschi il secondo. I dati in Tabella 1 sono relativi all’analisi del DNA mitocondriale e a due differenti livelli di indagine realizzati sui dati del DNA nucleare.

Tutti gli individui sono risultati appartenere, come atteso, al gruppo aplotipico marmoratus (DNA mitocondriale) (eccetto 1 campione per cui il dato è mancante). L’analisi genetica sul DNA nucleare, più informativa e completa, ha evidenziato in cinque individui la possibilità di un genoma poliploide. Questi cinque campioni sono stati esclusi dalle successive analisi dei dati. Il primo livello di analisi di dati nucleari era mirata a valutare il grado di purezza degli individui marcati all’interno dell’impianto di Rovereto. Il valore ‘P marmorata’ indica la probabilità che l’individuo appartenga al gruppo marmorata, mentre il valore ‘P fario’ la probabilità che appartenga al gruppo fario. Tali valori possono essere interpretati, per semplificare, come indici di ibridazione. Poiché tali va­lori vengono stimati su basi probabilistiche, in nessun caso sarà mai possibile trovare un indice P marmorata = 1 e P fario = 0 (o viceversa). Ciò non significa che nessun individuo sia effettivamen­te puro. Come si vede dalla Tabella 1, 30 individui hanno evidenziato una probabilità superiore al 95% di appartenere al gruppo marmorata, e ulteriori 10 individui una probabilità superiore al 90%. Stando dunque a questi risultati, appare che i livelli di ibridazione degli individui marcati siano assolutamente contenuti, se non nulli.

Il secondo livello di indagine ha fornito alcune indicazioni sulla appartenenza degli individui considerati puri ai tre ceppi di marmorata individuati nell’ambito del progetto. In Tabella 1, nelle colonne ‘P Alto TN’, ‘P Basso TN/VR’ e ‘P Slovenia’ è indicata la probabilità di appartenere a ciascuno dei tre ceppi. Tutti gli individui provenienti dal lotto 1, eccetto 1, inclusi nell’analisi risultano con probabilità significative riferibili esclusivamente al ceppo del basso Trentino/Veronese, mentre negli individui provenienti dal lotto 2 si evidenzia la presenza costante di due componenti riferibili al ceppo del basso Trentino/Veronese e, seppur in percentuale minore, al ceppo dell’alto Trentino. E’ quindi logico interpretare che il lotto 2, pur costituito da marmorate per la maggior parte pure, sia stato costituito a partire da individui appartenenti ai due diversi ceppi potenzialmente autoctoni del Trentino. In nessun caso è stata evidenziata negli individui dell’impianto di Rovereto una componente genetica riferibile al ceppo sloveno. 

L’esperimento di incrocio 

Tra tutti gli individui stabulati presso l’impianto di Rovereto, 12 riproduttori (6 maschi e 6 femmine) sono stati scelti dopo aver effettuato l’analisi genetica mediante otto marcatori microsatellite. Le uova ottenute dagli incroci (in totale 36 famiglie) sono state poste in un incubatoio verticale a 5 °C; le uova embrionate sono state tra­sferite poco prima della schiusa in vaschette apposite e mantenute separate ad una temperatura di circa 11 °C. Sono stati effettuati conteggi per valutare la mortalità delle uova e degli avannotti tre volte a settimana per avere una stima della mortalità entro famiglie. E’ stata eseguita una prima analisi (ANOVA) per valutare la differenza di dimensioni delle uova in ogni famiglia e l’effetto che su questo parametro é determinato dalla madre, dal padre e dall’interazione dei due: la dimensione delle uova è risultata essere influenzata da tutti questi fattori. Mentre è facilmente intuibile che diverse madri possano produrre uova di dimensioni differenti, più interessante è il fatto che le stesse uova possano assumere dimensioni significativamente differenti se fecondate da differenti maschi. Inoltre, non sempre la stessa madre e lo stesso padre saranno in grado di determinare le massime dimensioni delle uova ma ciò sarà possibile solo per particolari incroci. Un significativo effetto materno e paterno sono stati osservati anche per quanto riguarda la mortalità delle uova.Dimensione e mortalità delle uova non risultano correlate.Per ogni famiglia è stata dunque calcolata l’eterozigosi attesa delle progenie (una stima della diversità genetica attesa calcolata a partire dai genotipi noti dei genitori) che è stata utilizzata per un’analisi di correlazione con i dati di dimensioni e mortalità. È stato osservato che la dimensione delle uova è positivamente e significativamente correlata con l’eterozigosi attesa delle progenie mentre la mortalità delle stesse è negativamente e significativamente correlata con i valori di eterozigosi. In altre parole, all’aumentare dell’eterozigosi aumenta la dimensione delle uova e diminuisce la mortalità. In termini pratici, è dunque ipotizzabile che la programmazione di incroci specifici utilizzando riproduttori scelti sulla base delle loro caratteristiche genetiche in sostituzione di un semplice approccio massale, possa portare a maggiori performance della progenie. Le stesse analisi sono state svolte sui dati di mortalità degli avannotti, ma non hanno prodotto risultati significativi. Ciò è probabilmente imputabile da un lato alla disponibilità di cibo ad libitum fin dal riassorbimento per gli avannotti (per cui la dimensione del sacco vitellino non è più un fattore di selezione) e, dall’altro, alle severissime condizioni selettive cui le uova sono state precedentemente sottoposte. Va infatti evidenziato che a causa di un malfunzionamento dell’impianto di refrigerazione dell’acqua di ricircolo, le uova sono state sottoposte prima ad un brusco innalzamento della temperatura (da 5 a 11 °C) e poi ad un periodo di incubazione ad una temperatura eccessivamente alta (11 °C) che ne ha determinato una schiusa precoce e un’elevata mortalità. Se tali condizioni non hanno certamente portato a buoni risultati da un punto di vista produttivo, da un punto di vista scientifico hanno costituito fattori selettivi estremamente rigidi ma comunque omogenei tra famiglie e quindi accettabili sperimentalmente. Per questo è stato ritenuto possibile ed informativo analizzare i dati ottenuti nonostante l’incidente. 

Indicazioni gestionali 

Lo strumento genetico ha reso possibile la determinazione dei livelli di purezza degli individui analizzati nell’ambito del progetto e della loro appartenenza a differenti ceppi di marmorata, in generale, e la caratterizzazione di quelli stabulati presso l’impianto di Rovereto, in particolare, evidenziando differenze rilevanti tra i due lotti di marmorate testati. E’ ovviamente auspicabile che tali informazioni diventino una base di conoscenza di cui le Associazioni, in primis APDV, facciano tesoro per impostare le loro attività ittiogeniche e per creare e selezionare i parchi riproduttori eventualmente mantenuti presso i propri impianti. E’ evidente che un supporto fondamentale all’utilizzo delle metodiche genetiche nelle pratiche gestionali dovrà essere garantito dall’Ufficio faunistico della Provincia, che già ha saputo fornire la massima collaborazione nell’ambito del progetto GAME, e auspicabilmente altrettanta disponibilità saprà dimostrare nel tradurre in pratica le indicazioni del progetto stesso. La massima ambizione del progetto GAME è costituita dal raggiungimento della piena condivisione di un unico piano gestionale della trota marmorata sottoscritto dalle tre province di Bolzano, Trento e Verona, per il raggiungimento del quale ancora molta strada resta da percorrere. Un primo importante traguardo tuttavia è già stato raggiunto, con l’ottenimento di dati scientifici e la traduzione e il trasferimento degli stessi in indicazioni gestionali fornite a disposizione degli Uffici faunistici provinciali e delle Associazioni. 

Il personale del progetto GAME 

Andrea Gandolfi                        IASMA                        Responsabile scientifico

Fernando Lunelli                        IASMA                        Coordinatore attività di campionamento

Francesca Baraldi                        IASMA                        Attività di campo e di laboratorio

Laura de Siervo                        AdB    Referente per l’Autorità di Bacino 

Tabella 1. Dati relativi agli individui campionati presso l’impianto di Rovereto verso la fine dell’anno 2007